Мазок периферической крови

Опубликовано Минутко Витали… - сб, 07/05/2022 - 14:28
Мазок периферической крови

Мазок или пленка ( film) периферической крови (PBF) представляет собой лабораторное исследование, которое включает цитологию клеток периферической крови, смазываемых на предметном стекле. Несмотря на достижения в области автоматизации гематологии и применения молекулярных методов, PBF остается очень важным диагностическим тестом для гематолога. Гематопатолог должен обеспечить мазок хорошего качества, тщательное обследование и правильную интерпретацию в соответствии с клиническим состоянием пациента.

Сканирование мазка крови служит как минимум для (а) проверки отмеченных автоматических гематологических результатов и (б) определения необходимости ручного дифференциального подсчета лейкоцитов. Исследование мазка крови / ручной дифференциальный подсчет лейкоцитов с полным анализом крови (ОАК) дает полную гематологическую картину случая, по крайней мере, с морфологической точки зрения.

Пока не появились автоматические анализаторы, каждый раз, когда выполнялся общий анализ крови, проводилось микроскопическое исследование мазка крови, так как определить процентное соотношение различных форм лейкоцитов (лейкоцитарную формулу) по-другому было нельзя. В современных анализаторах подсчет лейкоцитарной формулы осуществляется автоматически. Однако при подозрении на наличие патологических форменных элементов крови микроскопия мазка крови опытным врачом по-прежнему является лучшим способом выявления и оценки атипичных и незрелых клеток. Существует достаточно широкий круг заболеваний и расстройств, при которых могут изменяться свойства клеток, циркулирующих в кровяном русле. В норме в кровь из костного мозга попадают только зрелые клетки, однако при ряде заболеваний, например при лейкозах, в кровь могут попадать незрелые клетки – бласты. При некоторых состояниях, например при массивной инфекции, в лейкоцитах могут появляться характерные примеси, сами клетки могут становиться атипичными, как при инфекционном мононуклеозе. Обнаружение в мазке патологических клеток в большом количестве позволяет заподозрить вызвавшее их заболевание и назначить дополнительное обследование.

Мазок крови может регулярно назначаться пациентам с онкологическими заболеваниями костного мозга, лимфоузлов для наблюдения за динамикой состояния и контроля за эффективностью лечения.

Мазок  периферической крови (PBF) является основным и высокоинформативным гематологическим инструментом, имеющимся в распоряжении врача для скрининга, диагностики и мониторинга прогрессирования заболевания и терапевтического ответа. 

Инициирование PBF часто является клиническим запросом лечащего врача из-за клинического подозрения или реже инициируется лабораторией, причем , последняя может инициировать исследование мазка периферической крови на основании ненормальных результатов автоматического подсчета или клинической информации  о  тех пациентах, чей диагноз может быть подтвержден данными пленки периферической крови.

Покилоцитоз и цитоплазматические включения, выявленные  в мазке периферической крови могут предоставить вспомогательные ключи для диагностики, например ,  сезарные клетки и пролимфоциты обнаруживаются только по морфологии. Пленка крови также важна для выявления диспластических изменений. 

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Однако индикаторы здесь  не являются конкретными, и ложно положительные находки  могут достигать 20% отмеченных выборок . Кроме того отмечно негативное влияние на рутинную работу лаборатории  добавления ненужных ручных проверок, которые отнимают у технолога время и ресурсы. И наоборот, ложноотрицательные результаты (аномальные образцы не помечены для анализа ) могут поставить под угрозу постановку правильного диагноза. Поэтому лаборатории должны выработать свои собственные правила анализа мазка, чтобы минимизировать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Ложноположительный показатель фиксируется здесь в 23% и ложноотрицательный показатель в 6,7%, что приводит к повторгной  оценке периферического мазка в микроскопе в 46% случаев.

Подготовка мазка периферической крови

Для обеспечения точных и надежных результатов необходимо контролировать предварительные аналитические переменные, которые могут повлиять на качество мазка. К ним относятся подготовка и согласие пациента, методика забора крови, транспортировка в лабораторию и хранение образца. Забор крови инвазивен, поэтому пациент / клиент должен быть проконсультирован перед проведением процедуры. Обычно кровь получают из периферических вен и хранят в пробирке  с антикоагулянтом. Соотношение крови и антикоагулянтов должно быть в правильной пропорции. Редко используют капиллярную кровь, которая  может быть получена при уколе пальца. Следует соблюдать осторожность, чтобы обеспечить минимальное повреждение тканей. Избыток тканевой жидкости влияет на распределение клеточных элементов крови. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) является предпочтительным антикоагулянтом. Образцы должны быть отправлены в лабораторию как можно скорее. Образцы лучше всего анализировать в течение 2 часов после забора крови. Задержка в приготовлении мазка крови может привести к дегенерации клеточных элементов крови и может привести к псевдотромбоцитопении (ложно уменьшенному количеству тромбоцитов) из-за образования агрегатов тромбоцитов.

Подготовка мазка (слайдов)  выполняется специально обученным персоналом, предпочтительно технологом медицинской лаборатории, который может обеспечить качественные слайды для микроскопии. Лаборанты также могут быть обучены искусству подготовки слайдов.

Для получения мазка периферической крови  требуются предметные стекла, пипетка / капиллярная трубка и шлифованное стекло . Используется метод «толкания» (клин) или скольжения ( первый метод применяется чаще). В методе клина, капля хорошо смешанной крови (минимум 10 мягких инверсий) помещается на основание предметного стекла близко к одному концу (около 1 см от края) с помощью пипетки / капиллярной трубки. Шлифованное стекло  со сколотыми краями помещается на базовый предмет перед кровью и перемещается назад, чтобы коснуться капли крови, что заставляет кровь распространяться по ширине предметного стекла.  Шлифованное стекло  должна иметь гладкий конец, чтобы предотвратить неправильную концевую часть мазка. Затем делают мазок с помощью шлифованного стекла, наклоненного под углом от 30 до 45 градусов к крови.  Мазок должен покрывать две трети длины базового предметного стекла и иметь овальный заостренный конец. Как правило, чем быстрее и круче мазок сделан мазок, тем он толще.

Высохший мазок фиксируют абсолютным метанолом или этиловым спиртом и окрашивают краской Романовского . Мазок, высушенный на воздухе, должен быть зафиксирован в течение 4 часов после приготовления, но предпочтительно в течение одного часа, причем хорошая фиксация требует от 10 до 20 минут.

Последовательность анализа мазка периферической крови

Морфология клеток крови на мазке PBF лучше всего анализировать  в соответствии с каждой линией гемопоэтических клеток. Распределение, размер, форма, цвет, клеточные включения эритроцитов и морфология других основных клеточных линий должны быть тщательно оценены. Однако некоторые аномалии, такие как «разбитые клетки» (мазки или пятна), могут быть артефактами и должны учитываться при составлении отчетов. Для оценки общего количества лейкоцитов, видимые клетки мазка должны быть включены в подсчет, чтобы избежать ложных результатов.

Мазок крови следует интерпретировать вместе с клиническими данными пациента (анамнез и физикальное обследование). Результаты других рутинных лабораторных исследований, включая общий анализ крови, скорость оседания эритроцитов, индексы эритроцитов, должны быть частью системы интерпретации мазка.

При микроскопии эритроциты нормального размера сопоставимы с размером ядра небольшого лимфоцита. Обычно эритроциты демонстрируют узкие различия в размере, что отражается в нормальной ширине распределения эритроцитов (RDW), составляющей 11-15%.  Широкий разброс размеров клеток описывается как анизоцитоз. 

Анизоцитоз коррелирует со средним объемом клеток (MCV), за исключением случаев сочетанного дефицита. Нормальный диапазон MCV составляет 76–96 фемтолитров. MCV <76fl предполагает микроцитоз, в то время как MCV> 96fl предполагает макроцитоз.   Макроциты могут иметь овальную (яйцевидную) или круглую форму, что имеет диагностические последствия. Овальный макроцитоз связан с мегалобластными анемиями (дефицит фолата или кобаламина), миелодисплазией и применением таких препаратов, как гидроксикарбамид. Включения эритроцитов часто являются результатом дефектного созревания эритроцитов, повреждения клеток окислителем или инфекций. Эритроциты с голубоватыми ретикулярными фрагментами (рибосомные белки и РНК) на суправитальном окрашивании являются ретикулоцитами.

Ядерные эритроциты обычно не видны на периферии, за исключением у новорожденных. Их присутствие на мазке  говорит о серьезной нагрузке на костный мозг, что вынуждает их преждевременно высвобождаться. Циркулирующие ядросодержащие эритроциты (эритробласты) могут быть связаны с увеличением количества циркулирующих предшественников нейтрофилов; в этом случае используется термин «лейкоэритробласты».

Лейкоэритробластоз возникает в условиях фиброза костного мозга, стрессовых факторов в костном мозге, наблюдаемых при гипоксии, тяжелой анемии (гемолитической или геморрагической) и тяжелом сепсисе, инфильтрациях в костном мозге (из-за лейкемии, лимфомы, миеломы или вторичного метастазирования), поражении костного мозга такими факторами роста, как G -CSF и экстрамедуллярный гемопоэз.

Аберрации в морфологии лейкоцитов согласуются с рядом патологий. Обычно лаборант вы видите от 2 до 5 лейкоцитов на поле высокой мощности (HPF). Как правило, лейкоцит / hpf приблизительно соответствует 200 и 2000 клеткам периферической крови при объективе х10 и объективе х100 соответственно. Коэффициент поля рассчитывается путем деления общего количества лейкоцитов на среднее количество лейкоцитов, наблюдаемых на десяти полях. Лейкоцитоз подозревается, когда лейкоциты> 5 лейкоцитов / hpf и лейкопения <2 клеток / hpf.

Зрелые нейтрофилы имеют сегментированное ядро ​​с 2-5 долями, соединенными тонкой нитью. Менее зрелые формы включают формы полос (колотые, ювенильные), метамиелоциты, миелоциты, промиелоциты и миелобласты в этом порядке. Цитоплазма зрелого нейтрофилов розовая или почти бесцветная, с умеренными азурофильными и    специфическими гранулам/

 «Сдвиг влево» - это термин, используемый для описания ненормального увеличения доли циркулирующих предшественников нейтрофилов. Обычно зрелые сегментированные нейтрофилы наблюдаются с популяцией полосовых нейтрофилов менее 8% и метамиелоцитов менее 0,5%. Тяжелая нейтрофилия с «левым сдвигом» называется лейкемоидной реакцией. При тяжелых инфекциях токсичные грануляции видны в цитоплазме нейтрофилов из-за компенсаторного увеличения микробицидных гранул

Лимфоидные клетки на периферии имеют различную морфологию. Обычно видна небольшая популяция лимфоцитов. Небольшие лимфоциты округлые с высоким ядерным цитоплазматическим соотношением (отношение N: C) и скудной цитоплазмой. . В крупных лимфоцитах отношение N: C ниже, а ядро ​​может быть круглым овалом или иметь менее конденсированный хроматин. Когда крупные лимфоциты имеют цитоплазматические гранулы, их называют крупными гранулярными лимфоцитами, и они представляют цитотоксические Т-лимфоциты или NK-клетки. С другой стороны, реактивные (активированные) лимфоциты являются большими с вдавленным или нерегулярным ядром, обильной цитоплазмой и могут содержать ядрышки.

Моноциты являются самыми крупными клетками на периферии с сине-серой цитоплазмой , как бы матового стекла. Ядро моноцитов ​​большое и принимает различные формы, но часто в форме подковы

Эозинофилы немного крупнее, чем полиморфы, а ядро ​​обычно двухлопастное. Их определяющей характеристикой является наличие оранжево-красных гранул в цитоплазме. 

Базофилы немного меньше, чем полиморфы, и имеют большие глубоко базофильные (голубоватые) гранулы, которые могут даже полностью затенить ядро. 

Неопластические лимфоидные бласты, когда они видны на пленке крови, также имеют большой размер, сравнимый с активированными лимфоцитами, но имеют высокое отношение N: C. Клетки лимфомы обнаруживаются в лейкемической фазе неходжкинских лимфом и обычно имеют различные размеры и различные морфологии ядра. Некоторые имеют одно глубокое ядерное расщепление (фолликулярные клетки), некоторые имеют множественные углубления и расщелины (мантийные клетки). Лимфоплазмацитоидные лимфоциты имеют эксцентричное ядро, синюю цитоплазму и некоторое перинуклеарное гало. Ворсинчатые лимфоциты, наблюдаемые в лимфоме маргинальной зоны селезенки, имеют биполярную цитоплазматическую проекцию, в то время как волосатые клетки, видимые при волосато-клеточном лейкозе, имеют перистые цитоплазматические проекции, распределенные вокруг цитоплазмы.

На мазке можно увидеть  приблизительно 7–15 тромбоцитов на объективе х100. Тромбоциты / hpf эквивалентны примерно 15 000 - 20 000 тромбоцитов в обращении.  Обычно крупные тромбоциты вызваны повышенной активностью мегакариоцитов из-за повышенной потребности. Сетчатые тромбоциты (более молодые более крупные формы) высвобождаются быстрее. Гигантские тромбоциты (размером с нормальную эритроцит или более) наблюдаются при наследственных состояниях, таких как синдром Бернарда Сулье, аномалия Мейя-Хаггелина или синдром Вискотта Олдрича, и приобретенных состояниях, таких как мегалобластная анемия и миелопролиферативные нарушения.

Показания

Распространенные клинические показания для анализа мазка  периферической крови включают необъяснимую цитопению: анемию, лейкопению или тромбоцитопению; необъяснимый лейкоцитоз, лимфоцитоз или моноцитоз; необъяснимую желтуха или гемолиз; особенности врожденных гемолитических анемий, таких как спленомегалия, желтуха или боли в костях; подозрение на хроническое или острое миелопролиферативное заболевание, например хронический миелолейкоз; подозрение на органную недостаточность, такую ​​как почечная недостаточность, печеночная недостаточность; особенности синдрома гипервязкости как при парапротеинемиях, лейкемическом гиперлейкоцитозе, полицитемии; тяжелый бактериальный сепсис и паразитарные инфекции; злокачественные новообразования с возможным поражением костного мозга; подозреваемые случаи пищевой анемии; подозреваемые хронические лимфопролиферативные заболевания, такие как хронический лимфолейкоз; лимфома с лейкемией.

Когда результаты лабораторных исследований получены, они должны быть занесены в отчеты и подписаны гематологом, особенно при значительном отклонении PBF. Типичный формат отчетности начинается с биологических данных пациента, номера больницы, запрашивающего врача, даты запроса, даты отчета и клинического резюме / сведений о пациенте. Основная часть отчета включает подробную характеристику каждой из основных линий гемопоэтических клеток: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Затем следует краткое изложение значимых результатов, вероятный диагноз с дифференциалами, другие рекомендуемые лабораторные оценки и разрешение подписи лабораторного врача с указанием даты.

Диагноз по мазку  крови должен быть согласован с клиническими особенностями пациента; лабораторный врач (гематолог / гематопатолог) занимает привилегированное положение, заключающееся в возможности сочетать симптоматику пациента с гематологическими данными для определения специфического диагноза или различий, особенно при первичных гематологических нарушениях и других системных заболеваниях с гематологическими проявлениями.